Growth Hormone과 IGF receptor

 뭔가 이런 학구적인 주제로 포스팅을 거의 하지 않는데, 지난 학기에 했던 소아과 북리딩 숙제가 그냥 잊기에는 많이 아쉬워서 이곳에 남기기로 했다. 소아과 유교수님의 숙제이기도 했는데 읽다보니 흥미로운 내용이 많고 이 부분은 평소에도 뭔가 중요한듯 하면서도 깊이 파면서 공부할 필요까지는 없는 그런 부분이라 '계륵'으로 여기는 경우가 많았다. 물론 국시에도 안나올 것이고...그럼에도 흥미롭다. 

 

 

<Disorders of GH/IGF secretion & action Part II>

 

<Growth Hormone(GH)>

1)   화학구조

-       Human GH:

n  아미노산 191개로 구성된 분자량 22-kD의 single chain protein

n  Mature form: 당화(Glycosylation)되지 않은 상태로 안에 2개 분자간 이황화결합

-       GH는 뇌하수체나 태반에서 생산되는 다른 여러 hormone과 공통 구조식 가짐

n  Chorionic somatomammotropin(CS, placentogen)

n  22-kd GH variant(hGH-V)와는 13개의 아미노산만 다름

n  GH, prolactin, placental용 geneà 공통 구조를 가지는데,

n  일반적으로 뇌하수체에서 가장 많이 생산되는 GH는 22kd 형태임

 

 

2)   Secretion

-       GH의 특징적인 pulsatile pattern secretion에 관련된 여러 조절자의 상호 작용

n  2가지 hypothalamic regulatory peptideà GHRH, SRIF(somatostatin)

u  GHRH(GH-releasing hormone), SRIF(somatotropin release-inhibiting factor)

u  GHRH의 아미노산으로 끝나는 말단 부위(tyrosine): GH 분비 자극에 필수적

u  GHRH 활성은, 종특이적이며 pituitary somatotrope의 G-protein receptor에 대한 결합의 특이성을 반영

 

-       GHRH 작용 à GH 유전자의 전사 및 분비를 유도

n  크게는 전사적(transcriptionally)으로 조절되며, AC(adenylate cyclase) 자극 및 세포 내 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 를 증가시켜

u  이미 형성된 GH 분비시키고

u  GH mRNA의 전사 및 새로운 GH 합성을 증가시킴

n  GHRH receptor: G-protein-coupled receptor family B(=secretin family)에 속하며, VIP(vasoactive intestinal polypeptide), secretin, calcitonin, 부갑상선호르몬 등의 receptor 등과 부분적으로 sequence identity를 가짐

n  GHRH 분비하는 solid tumor는 GH 과잉의 드문 원인일 수 있음

n  GHRH는 미국에서 GH deficiency(GHD)의 치료로 승인되었지만, 치료목적으로의 사용은 시장에서는 철회되고 현재 진단 목적으로 사용되며, 특히 성인 GH deficiency를 확인하는데 사용됨

 

-       Somatostatin 작용 à GH의 기저치와 GH의 파동 횟수 및 진폭을 억제

n  GH 합성보다는, pulsatile한 GH 분비의 타이밍과 진폭 크기(amplitude)에 연관

n  Somatostatin(성장호르몬 분비 억제하는 호르몬)이 특정 receptor에 붙으면

u  AC 활성의 억제 및 세포 내 Ca 농도 감소 효과

u  배양한 GHRH과 somatostatin을 가진 somatotropic cell 치료 à 새포 내 Ca 농도 감소와 함께 GH 분비 억제하며 강한 somatostatin 효과 보임

n  생체 내 GH의 pulsatile secretion은 hypothalamic somatostatin 분비의 지속적 감소 및 GHRH 활성 증가에 기인한 것으로 여겨짐

n  GH 분비 저하(trough): GHRH 활성 감소상태 + somatostatin 분비 증가시 발생

n  Somatostain analogue:

u  acromegaly 등 치료에 사용(GH secretion inhibitor로서의 역할은 과소평가됨)

 

-       GHRH와 somatostatin의 상호 분비 작용 조절은 신경학적으로 완전히 이해되지는 않음

n  Serotonin, histamine, NE, dopamine, Ach, GABA, TRH, VIP, gastrin, neurotensin, substance P, calcitonin, neuropeptide Y, vasopressin, CRH, galanin 등 많은 neurotransmitter와 neuropeptide가 이런 hypothalamic factor의 분비 조절에 연관

n  이런 요인들은 다양한 생리적 상황(스트레스, 수면, 출혈, 금식, 저혈당, 운동 등)에서 관찰되는 GH의 분비 변화와 밀접하게 연관되며, GH 분비 용량/저장량(GH secretory capacity/reserve)을 평가할 때 얼마나 많이 GH-자극 검사를 해야 하는지에 대한 기초 자료 제시

-       GH 분비는 또한 androgen, estrogen, thyroxine, glucocorticoid 등 다양한 non-peptide hormone에 의해 영향 받음

n  GH 분비를 조절하는 이런 호르몬들의 정확한 기전은 복잡,

u  잠재적으로 hypothalamus와 pituitary level에서의 활성과 연관

u  임상적으로, 갑상선기능저하증과 glucocorticoid 과잉은 각각 자발적인 GH 분비나 유발되는 GH 분비 감소시킴(즉 GH testing 앞서 반드시 치료 해야 함)

u  사춘기 시작 때나 약으로 주입된 경우에 있어, Sex steroid는 사춘기의 특징적인 GH 분비 증가의 원인으로 여겨짐

-       GH-releasing peptide(GHRPs): GH 분비를 자극할 수 있는 합성 hexa-peptide 발명됨

n  나중에 gastric hormone인 ghrelin의 analogue로 여겨진 GHRPs는        

u  직접 GH 분비를 자극할 수 있고

u  GHRH에 대한 GH의 반응을 증강시킬 수 있음

n  GHRPs 장점:

u  경구투여 가능

u  pituitary가 intact한 환자에 있어 GH 분비를 크게 증강

n  GHRPs 지속 투여시à GH pulse의 진폭크기(amplitude)는 유의하게 증가

n  GHS-R(GH secretagogue, 성장호르몬 분비촉진제 - receptor):

u  GH-releasing 물질에 대한 공통된 receptor (주로 Ghrelin-mimetic ligands 사용)

u  GHS-R은 GHRH receptor와는 다름

l  GHS-R gene을 복제 결과à unique한 G-protein-coupled receptor를 나타남

l  사람, 쥐와 96% 동일한 protein sequence를 가짐

l  3가지 isotype 갖는 receptor가 인간 게놈 library에서 동정

à이 receptor 돌연변이 à 다양한 정도의 GH insufficiency 및 저신장 초래

n  Ghrelin

u  28개 아미노산으로 이뤄진 peptide

u  hypothalamus, stomach 등에서 발견되며, GHS-R용 endogenous ligand로 밝혀짐

u  정상 기능을 하기 위해선 Acetylation이 되어야 함

u  동물 실험에서 IV, intracerebroventricular, intraperitoneal로 ghrelin 투여 결과

l  음식 섭취를 자극하여 비만을 초래

l  plasma의 GH 농도를 올리는 효과

l  but, ACTH(Adrenocorticotropic hormone) level은 상대적으로 덜 상승

u  Ghrelin receptor mutationà ISS(idiopathic short stature)의 가능한 원인 중 하나

u  즉, Ghrelinà 성장 및 대사 위한 영양분 분배 있어 중요한 자극원, GH 조절 시스템의 핵심 요소임

n  Obstatin: Ghrelin과 같은 유전자에서 encoding 되는 2번째 peptide

u  GH 분비 조절은 하지 않고, 체중 조절에 관여

-       Pituitary-specific한 전사인자의 이상은 유전적 저신장을 유발

n  POU1F1(Pit-1): somatotropes, lactotropes, thyrotropes 의 발달조정에 관여

u  즉 POU1F1 발현 이상은 GH, TSH, PRL 등 다양한 pituitary deficiency와 관련

u  POU1F1 gene 돌연변이는 유전적인 multiple pituitary hormone deficiency 관련

 

-       GH 합성 및 분비는 또한 IGF(insulin-like growth factor) peptide 의한 feedback 의해 조절

n  IGF receptor는 pituitary에서 발견됨

u  IGF-1 의한 GH 분비 억제 실험은 여러 장기(system)에서 시행

u  Recombinant IGF-1의 subcutaneous injection 받은 환자에 있어 자연적인 GH 분비 억제에 대한 실험도 시행

n  임신 1분기 말에 태아의 serum에서 GH 확인됨

u  GH level은 만삭인 영아가 조산아보다 더 낮은데à gestation의 후기 stage의 특징적인 IGF peptide 혈중치 상승에 의한 feedback 작용 때문으로 보임

-       청소년기에 GH 분비가 peak을 이루는 것은, 사춘기 때 IGF-1 혈중 수치가 매우 높아지는 것에 기여함

n  GH 분비는 청소년기 후기 때 감소하기 시작하며, 성인기를 통해 지소적 감소

n  사춘기는 “acromegaly” 시기를 어느 정도 보일 수 있다는 것을 고려해야 하고

n  반면 노화(aging)은 특징적인 GH 분비 감소와 더불어 somatopause라 칭해짐

-       성인 남자에서 정상인 24시간 GH 생산 속도(rate)는 0.25~0.52 mg/m2 임

n  그러나 노화를 포함한 많은 생리적인 상태가 GH 분비에 영향

u  수면 단계, 영양 상태, 갑작스런 금식, 운동, 스트레스, 성호르몬 등

u  Ho 등에 따르면, serum estradiol 농도가 GH 분비에 가장 중요한 요소라고 함

l  Estradiol을 분석에서 제거한다면, 나이와 성별은 GH의 종합적인 혈중 수치에 크게 영향 미치지 않음

u  Testosterone의 혈중 IGF-1 농도에 대한 효과는 적어도 GH와의 관련에서 부분적으로 독립적임à GH receptor에 돌연변이를 가진 사람은 사춘기 시절에도 여전히 IGF-1 level 상승을 경험함

-       GH 분비의 pulsatile한 성질은 잦은 serum sampling을 통해서도 알 수 있음(특히 sensitive한 GH assay와 함께 검사하면 더 두드러짐)   

n  정상 상태와 GH burst 사이 혈중 GH 농도는 0.2 ng/mL 미만임

n  즉 Random한 serum sampling으로 GH 분비 평가한다는 것à 유용하지 못함

-       최대 GH 분비는 밤에 발생, 특히 첫번째 slow-wave sleep(stage 3, 4)에 발생

n  반면 REM sleep은 낮은 GH 분비와 연관

-       정상 젊은 남자는 일반적으로 24시간 동안 12번의 GH secretory burst를 겪음

-       비만은 감소된 회수의 GH burst에 따른 GH 분비 억제로 특징되어짐

-       금식은 GH secretory burst의 회수와 정도를 증가시키며, 감소된 somatostatin 분비 반영함

-       GH의 pulsatile secretory한 특징이 생물학적 활성에 어떤 영향을 미치는지는 아직 미지수

    

3)   GHR(GH Receptor)/GHBP(GH-binding protein)

-       GH Receptor: 638개 아미노산으로 합성, 후에 620개 아미노산 가진 성숙형 receptor, glycosylation 전에 70kDa의 분자량 가짐

-       세포 밖 hormone-binding domain: 246개 아미노산으로 구성

n  인간의 circulating GH-binding protein(GHBP)

u  Receptor의 세포 밖 domain이 잘려나 나가 순환하는 것에서 유래

-       사람 GHR gene: 염색체 5p13.1-p12에 위치하며 87kb까지 확장됨

n  반면 mouse, rat은 여러 종류의 transcript 발견됨

-       Human GHR의 coding region 및 3’-untranslated region은 9개의 exon(2~10번)으로 encoding 됨

n  Exon 2: signal peptide 분비

n  Exon 3~7: extracellular domain을 encoding

n  Exon 8: transmembrane domain을 encoding

n  Exon 9: intracellular domain encoding

n  Exon 10: 3’-untranslated domain encoding

n  GHR의 exon 3는 정상 개인에 비해 상당히 많이 제거되어 있기도 한데(delta-3 GHR polymorphism), 이것이 모두 GH에 대한 반응을 결정하거나 출생 사이즈, 생후 성장 등과 연관이 있는 것은 아님

-       GHR은 prolactin receptor와 매우 유사하며, erythropoietin, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, interferon, interleukin 등의 receptor와 sequence를 공유(GHR은 class 1 hematopoietic cytokine family의 일종)

n  최근 GH와 GHBP 분자 complex에 대한 이해가 GH 단독 연구에 비해 더 효율적임 밝혀짐à 생리학적으로 GHBP의 치료 역할에 대한 것

n  GH-GHR complex에 대한 결정 구조에 대한 연구는, complex가 GH 한 분자가 2개의 GHR 분자에 부착되어 있음을 밝혔으며 이것은 GH action에 필요한 GH-induced receptor dimerization을 의미

n  흥미로운 것은, 유전적으로 합친 GH와 GHR complex는 최근 GH 단독으로 실험했을 때 보다 효율이 더 증가하고 반감기가 극적으로 길어졌음이 밝혀짐

-       GH는 receptor에 붙어 receptor dimerization 유도 후, 120kd의 protein의 인산화를 자극함

n  JAK2(Janus kinase 2): 주요한 GHR 관련 tyrosine kinase로, GH action 관련

u  GH가 membrane-associated GHR에 붙어 à GHR을 dimerazation 시키고 à GHR과 JAK2를 interaction 시켜 à JAK2와 GHR에 tyrosine을 phosphorylation 시킨 뒤에 ànuclear protein을 phosphorylation과 dephosphorylation 시킨 후à target gene transcription을 자극하는 것

u  GHR 그 자체로는 내재된 kinase 활성이 없으며, 2개의 JAK2 분자가 dimerized GHR에 의해 함께 위치하는 것이 각각의 JAK2가 transphosphorylation 되어 결국 JAK2를 활성 시킴

u  활성화된 JAK2는 여러 tyrosine site에서 GHR을 인산화 시킴

n  GH와 JAK2에 의존적인 인산화 및 활성화는 다양한 STAT(signal transducer and transcription activator)에 의해 진행됨: STAT1, STAT3, STAT5

u  이런 세포 내 protein 들은 homodimer나 heterodimer를 형성 한 후 à nucleus로 translocation한 뒤 DNA에 붙어서 전사를 활성시킴

n  다른 GH-activated pathway: MAPKs, ERK-1, ERK-2, insulin-signaling path, PKC 등

n  이런 pathway에서 GH의 다양한 동화 및 대사 작용은 다음과 같음

 

 

 

-       체내 GHBP: GH와 높은 특이도 specificity 및 친화력 affinity, but 상대적으로 낮은 용량

n  GHBP는 GHR의 extracellular domain의 중요 요소이며 약 55kDa의 무게 가짐

u  GHBP에 대한 첫번째 assay는 serum에서 125-I-GH를 배양하고 gel filtration, 고압 liquid chromatography, dextran-coated charcoal 등을 통해 free radioligand로부터 분리 시키는 것임

u  Carlsson 등은 ligand-mediated immunofunctional assay(LIFA) 발명: GH에 붙을 수 있는 GHBP 측정

u  GHBP의 혈중 농도를 측정하는 assayà GHR의 유전적 기형에 의한 GH insensitivity(GHI) 환자를 확인하는데 사용, but GHI 환자 중

l  GH receptor가 없거나

l  GHR의 intracellular 부분에 문제가 있거나

l  dimerize가 안되는 문제가 있는 경우에 있어서는 GHBP는 정상 수치

-       여러 GH-inducible suppressor of cytokine signaling(SOCS) 의한 GH signaling의 억제

n  거대증을 보인 SOCS-2 knockout mouse(특정유전자 제거한 쥐)에서 성장을 조절하는데 중요한 SOCS protein의 중요성에 대한 증거 발견

n  반면 SOC가 overexpression 되었을 경우 signal transducer인 STAT4와 STAT5-dependent 한 전사활성에 대한 GH 활성이 완전 억제

n  SOC는 JAK2의 GHR-dependent tyrosine phosphorylation을 억제함

n  IL-1b나 TNFa 등의 endotoxin 및 proinflammtory cytokine은 GH resistance를 유발

u  이런 모든 agent는 또한 SOC protein을 유발 가능 à IL-1b나 TNFa 또는 생체 내 endotoxin 등 의해 유발된 SOCS-3는 sepsis에 의해 유발된 GH resistance 유발에 중요 작용         

u  한편 GH 치료를 받고 septic shock 빠진 환자는 사망률이 올라가며, 이것은 sepsis의 결과 특정 조직에 GH resistance가 유발된 것과 관련

u  즉, intracellular GH signaling antagonist인 SOCS protein의 역할은 다양한 병태생리 상황에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 여겨짐

      

4)   GH Actions à 성장효과 & 대사작용

-       ‘Somatomedin hypothesis’에 의하면, GH의 동화 작용은 IGF peptide에 의해 매개됨

n  Somatomedin =IGF-I

n  이 가설은 대부분 맞는 말이지만, GH의 다양한 자극 작용은 IGF 활성과는 무관

n  게다가, GH와 IGF의 효과는 어떤 면에서는 모순됨

u  GH의 “당뇨병 유발적(diabetogenic)” 작용 Vs IGF의 혈당을 낮추는 효과

u  GH는 세포 내로의 포도당 섭취를 줄여 당뇨병 유발적인 작용을 함

-       이런 차이점 해결 하고자, Green 등은 ‘이중 작용자 모델(dual effector model)’ 연구

n  GH가 prechondrocyte 같은 전구 물질을 분화 하도록 자극à 분화된 cell과 주위 cell 들이 IGF를 분비à 이런 peptide는 분열촉진 물질(mitogen)로 작용 à 클론증식(clonal expansion)을 자극함

n  이런 가설은 IGF peptide가 혈관을 통해 운반되는 전통적인 내분비 요소일 뿐 아니라 paracrine이나 autocrine growth factor로서도 작용을 한다는 것에 기반함

-       GH는 또한 다양한 대사 작용을 자극하는데 이것은 IGF 생산과 독립적으로 발생함

u  Lipolysis: 지방 조직으로부터 지방산 동원 증가

u  횡경막과 심장에서의 아미노산 이동: IGF-1을 매개로 아미노산 섭취를 증가

u  특정 간 단백질의 생산 등: mRNA의 전사 해독을 직접 향상시켜 단백합성 증가

n  또, GH 작용하는 다양한 site 있으며, 흔히 이것은 IGF system에 의해 이뤄진다고 명확하게 밝혀지지 않으며(GH의 IGF-independent effect 의미) 이런 site의 예로는

u  Epiphysis: 골단(epiphyseal) 성장을 자극

u  Bone: 파골세포(Osteoclast) 분화 및 활성 자극, 골모세포(osteoblast) 활성 자극, 연골 내 골화작용 촉진(endochondral bone formation 통해 bone mass 증가)

l  Lupu 등은 IGF-I를 완전 Knockout 시킨 쥐가 GHR knockout 시킨 군에 비해 훨씬 작아진다는 것을 통해 GH의 성장에 있어 IGF-independent한 효과를 밝힘

u  Adipose tissue: acute insulin-like effect 가짐(=지방분해 증가, lipoprotein lipase 억제, hormone sensitive lipase 자극, 감소된 glucose 이동, 지방형성 억제)

u  Muscle: 아미노산 운반 증가, 질소 저장 증가, 근육 동화작용, 에너지 소비 증가

l  IGF-independent한 GH 작용을 지지해 주는 생체 내 실험: GH의 모든 효과를 IGF-1이 할 수는 없었음(nitrogen retention이나 insulin resistance 등)

n  노화 및 이화작용에 있어 GH의 효과는 현재 연구 중

 

 

 

<Insulin-like Growth Factors(IGF)>

 

1)   역사적 배경

-       IGF(=somatomedin)는 적어도 어느 정도는 GH-dependent 하며, GH의 많은 동화작용 및 유사분열 촉진 작용(mitogenic)에 매개 역할을 한다고 여겨지는 물질

n  지난 45년간 다양한 대사 활동에 대한 것이 밝혀짐

-       1957년, Salmon과 Daughaday, pituitary 제거 쥐에서 나온 serum이 쥐의 chondrocyte proteineoglycan을 형성하기 위한 황산염 결합을 촉진시키는 능력이 GH의 ‘추가’에 의해 복구될 수 없음을 밝힘

n  그러나, 황산염 결합 촉진 능력은 pituitary를 제거한 뒤 GH로 치료 받은 쥐에서 나온 serum을 추가함으로서 회복될 수 있음 à 즉 GH-dependent “황산화인자(sulfation factor)”의 존재를 밝힘 

-       쥐의 근육과 지방세포에서 insulin 작용에 대한 연구에 따르면

n  정상 serum에서 아주 적은 양의 insulin-like activity는 anti-insulin antibody의 첨가의해 방지 가능 à but 이때 남은 작용은 NSILA(nonsuppresssible insulin-like activity)라 하며 이것은 수용성인 7 kd 형태(NSILA-I, NSILA-II)

-       Dulak과 Temin은 소의 serum에서 mitogenic 성질을 연구

n  Fetal buffalo rat의 간세포에서 얻은 media(BRL-3A)는 배양된 세포의 성장을 도와주는 것으로 밝혀졌으며, media의 mitogenic factor는 MSA(multiplication-stimulating activity)라 불리며, sulfation factor 및 NSILA와 함께 대사 및 유사분열 촉진 작용(metabolic and mitogenic activity)을 공유하는 것으로 알려짐

-       1972년, sulfation factor 와 NSILA는 SM(somatomedin)이란 이름으로 불리게 됨

n  SM의 특성:

u  혈중 농도는 반드시 GH dependent하며

u  골격 외 조직(extraskeletal tissue)에서 insulin-like activity를 가지고

u  연골에서 황산염(Sulfate)의 cartilage로의 결합(incorporation)을 촉진하며

u  DNA 합성 및 세포의 증식 촉진함

n  이러한 것을 정제하려는 노력은 2개의 somatomedin peptide를 생산

u  SM-C: basic peptide

u  SM-A: neutral peptide

-       1978년, Rinderknecht와 Humbel은 proinsulin과 구조적으로 매우 유사한 2개의 활성 somatomedin을 사람의 혈장에서 동정하는데 성공à 따라서 이 2개는 IGFs(insulin-like growth factor)로 다시 이름을 바꿈

 

 

  

2)   IGF 구조 및 분자생물학

-       IGF-1, 2는 구조적으로 유사하며 73개의 가능한 아미노산 위치에서 45개를 공유

n  IGF-1: SM-C와 관련된 basic peptide가 70개 아미노산으로 구성

n  IGF-2: 약간 산성의 peptide로 67개의 아미노산으로 구성

-       그리고 이들이 가진 아미노산 중 약 50%는 insulin과 유사성 보임

n  Insulin과 같이, IGF-1, 2 모두 disulfide bond로 연결된 A, B chain을 가짐

n  반면 connecting region(C-peptide)는 IGF-1은 12개, IGF-2는 8개 아미노산을 가지며 proinsulin의 C-peptide region과는 다름(carboxyl-terminal extensino인 D-peptide도 각각 8, 6개의 아미노산을 가지므로 proinsulin과 다름)

n  이런 구조적 유사성은

u  IGF 1, 2가 insulin receptor에 붙는 능력이 있다는 것과

u  Insulin이 type 1 IGF receptor에 붙을 수 있다는 것을 설명해 줌

u  반대로, 구조적 차이점은 insulin이 IGF-binding protein에 붙지 못하는 것을 설명

-       2가지 다른 형태의 IGF-1 전구 분자가 발견됨: IGF-1A, IGF-1B

n  70개 아미노산으로 구성된 Signal peptide, 48개 아미노산으로 된 mature IGF-1 분자, 전구체 E domain의 첫 16개 아미노산으로 구성된 첫 134개 아미노산은 동일

n  IGF-1A는 19개, 1B는 61개의 아미노산이 추가

-       IGF-1 gene의 Alternative splicing은 2가지 종류의 messenger RNA(mRNA)를 생성

n  사람과 쥐에서의 주요한 IGF-2 translation 생산물은 24개 아미노산으로 구성된 잔여 signal peptide 및 67개 아미노산으로 이뤄진 mature IGF-2 sequence와 89개 아미노산으로 된 carboxyl-terminal E-peptide로 된 180개 아미노산을 가짐

-       IGF gene expression의 조절은 복잡하며, 여러 조직에서 뿐 아니라 배아, 태아, 소아 및 성인에서의 발현 정도가 다름

n  IGF-1,2: 하나의 gene에서 encoding, 각각 95, 35kb의 genomic DNA로 spanning 됨

n  인간의 IGF-1 gene은 12번 염색체의 장완에 위치하며 IGF-1 gene은 적어도 6개의 exon을 가짐

u  Exon1,2: alternative signal peptide encode

u  Exon3, 4: 남은 signal peptide, mature IGF-1 나머지, trailer peptide 일부 encode

u  Exon5,6: 39개 untranslated sequence 및 대신 사용되어진 IGF-1A 및 IGF-1B form이 되는 trailer peptide를 encode

n  인간 IGF-2 gene은 11번 염색체 단완에 위치하며, insulin gene과 가깝고, 9개 exon을 가진 35 kb의 genomic DNA로 spanning 됨

u  Exon 1~6: 다양한 promoter site를 포함한 59개 untranslated RNA를 encode

u  Exon 7: signal peptide와 대부분의 mature protein encode

u  Exon 8: protein의 carboxyl-terminal 부위 및 coding이 exon 9에서 끝나는 trailer peptide를 encode

n  이러한 결과 다양한 mRNA 종이 IGF-1 과 IGF-2에 존재à 이것은 유전자 발현 조절을 매우 복잡하게 하였고, 개체발생 조절 및 호르몬 조절 뿐 아니라 특정 transcript의 tissue-specific expression을 가능하게 함 

3)   IGF peptides assay 방법론

- 1957년 IGF peptides를 처음 동정한 후, 정확한 측정을 하는 것은 매우 어려운 일임이 밝혀짐.

n  Bioassay 방법이 어려운 이유

u  serum 내에 존재하는 유사물질과 IGF action을 방해물질 의해 종종 영향 받게 됨

u  더 중요한 것은 모든 assay 는 IGF binding proteins(IGFBPs)의 존재에 영향을 받게 됨(IGFBPs는 모든 biologic fluid내에 존재)

- bioassay 방법

n  stimulation of 〔35S〕sulfate incorporation(황산염결합 자극)

u  Salmon과 Daughaday에 의해 기술된 original 방법. 다양하게 변형된 방법도 사용됨

(예: Stimulation of DNA synthesis, RNA synthesis, protein synthesis, glucose uptake등)

u  단점: IGFBPs의 방해를 받게 되며, IGF-1과 IGF-2를 구별 할 수 없음

n  Radio receptor assay, Competitive protein binding assays 개발

u  장점: specific Ab를 이용해 IGF-1과 IGF-2를 정확히 구별해서 측정 가능

n  Double antibody sandwich assay방법: specific Ab 사용

u  장점: ELISA 같은 방법으로 정확도와 재현성 높음

u  단점: 여전히 IGFBPs의 문제는 어떤 IGF assay에서도 해결되지 않고 있음

예) uremic sera assay for IGF, Radio receptor assay, radioimmunoassay 모두 IGFBPs 영향 받고, Ab를 이용한 방법조차도 IGFBPs영향 받음

 

- 일반적으로 IGF peptides와 IGFBPs를 분리하는 가장 효율적인 방법

n  산성 환경하에서 sizing chromatography 이용

u  IGF-1, IGF-2 분자량: 7 kd Vs IGFBPs 분자량: 25 ~ 45 kd

u  단점: 비록 이 방법이 대부분의 serum sample들에서 효과, but IGFBP/IGF peptide ratio 높은(신생아, GHD, uremia 등) 상태의 cell line과 serum에서 효과 좋지 않음

 

- 대체적인 방법

n  IGF-1, IGF-2의 C-peptide region 같은 종합 peptide에 작용하는 Ab 이용

u  단점: 이런 Ab는 특이도는 높지만 친화도가 상대적으로 낮음

u  But, radio labeled peptide는 endogenous IGFPs에 결합하지 않는다는 장점

 

- 현재 IGF assay 중 가장 정확하고 효과적인 방법

n  Enzyme linked immune sorbent assay(ELISA), Immunoradiometric assay

u  sandwich assay와 유사한 방법을 사용해 IGFBPs의 간섭을 최소화 하는 방법

u  장점: Radio labeled IGF 분자를 사용하지 않음

n  Radio labeled IGF 분자: IGFBPs에 결합 가능à 이것으로 인해 IGFBPs가 높을 때 결과오류가 생길 수 있기 때문

 

 

4)   Serum Peptide level of IGF

- serum IGF-1 level 나이에 따른 변화

n  태아 serum IGF-1 level: 상대적으로 낮고, 재태 연령과 관련해 양적 상관관계가 있다.

태아 탯줄 serum IGF-1 level과 출생체중의 관계에 대한 연구 중 몇몇 연구는 상관관계가 있다고 보고, but 일부 다른 연구는 상관관계가 없다고 보고

 

n  신생아 serum IGF-1 level: 일반적으로 성인 level의 30~50%정도

n  유년기를 거치면서 serum 농도가 점점 증가해, 성적 성숙이 시작될 때 성인 level 도달

n  사춘기가 진행하는 동안, IGF-1 농도가 성인 보다 2~3배 농도로 상승

u  사춘기 동안 농도: 역연령(chronologic age)보다 Tenner stage(뼈 연령)와 상관관계

u  Gonadal dysgenesis가 있는 소녀: 사춘기 때 serum IGF-1 상승을 보이지 않는 것을 보아, sex steroids 생성이 사춘기 때 IGF-1 상승과 관련이 있는 것이 확실

l  Sex steroid와 간접적 관계: Sex steroids가 사춘기 때 상승하면 à GH 분비를 유도해 à IGF-1 생성에 간접적인 영향

l  Sex steroids와 직접적 관계: GHR maturation으로 인한 GHI가 있는 환자는 GH level이 감소 했음에도 불구하고 사춘기 때 serum IGF-1이 상승à 따라서 IGF-1에 sex steroids가 직접 연관되어 있을 것이라 생각됨

n  사춘기 후, 최소한 20,30대가 되면 serum IGF-1 농도는 점차 나이와 관련해 감소

u  원인: 음성 질소 평형, 몸의 근육 감소, 나이에 따른 osteoporosis 관련

u  비록 아직까지 ‘provocative 가설’ 증명되진 않았지만, 정상 연령에 따른 GH+ IGF-1 치료의 잠재적 사용에 관심

 

- serum IGF-2 level 나이에 따른 변화

n  신생아의 IGF-2 level 은 일반적으로 성인 level 의 50% 정도

n  하지만 1세 때, 농도가 감소하여 7~8세 때 신상아 때 수치로 서서히 되돌아 옴

n  사람의 이런 IGF-2 농도 변화: rat, mouse와는 완전히 다른 패턴

n  Rat, mouse serum IGF-2 level: fetus때 가장 높고 출생 후 점점 감소해 adult때는 거의 측정되지 않음

5)   성장 장애에서 IGF level 측정

- IGFs의 GH 의존에 대한 연구가 Salmon과 Daughaday에 의해 최초로 발표

n  Radio immunoassays의 민감도와 특이도가 발전함에 따라 IGF-1과 IGF-2의 구별도 가능해져, GH 상태에 따른 serum IGF level의 관련성에 대해서도 연구 중

u  각각의 IGF peptide를 개별적으로 측정하는 것의 장점: IGF-1 농도는 IGF-2 농도에 비해 더 GH 의존적이며, GH 분비 패턴의 변화를 밝혀내는데 유용하다.

u  하지만 Serum IGF의 농도는 역연령, 성 성숙 정도, 영양상태에 큰 영향을 받음

n  결과적으로 나이에 맞는 정상 수치를 설정하는 것이 중요

n  5살 미만의 정상 소아: IGF-1 level 매우 낮기 때문에 정상 범위와 GH deficient children의 수치가 상당부분 일치하므로 감별에 주의

 

- Ranke 등은 키가 5^th percentile 미만의 아이들 400명에게서 GH stimulation test 시행

n  IGF-1의 수치를 측정함으로써 GHD(Growth hormone deficiency) 진단을 대신

n  Standard provocative test를 통해 GH 결핍을 진단 받은 아이들은 매우 낮은 IGF-1 level

n  But, GH 결핍 환자와 저신장이지만 GH level 정상인 아이들à serum IGF-1 level 상당 부분 일치

n  뼈연령이 12세 이상인 아이들에 한해서만 serum IGF-1 level로 GHD와 정상 저신장 아이들 확실하게 구별 가능

 

- 유사하게 Rose 등은 낮은 provocative GH 또는 낮은 overnight GH 농도를 가진 아이들이 serum IGF-1농도가 낮기는 하지만 정상 GH농도를 가진 아이들과 비교했을 때 극적으로 낮지는 않다는 것을 밝힘

 

- Rosenfeld 등은 68명의 GHD 아이들과, 197명의 정상 신장 아이들, 44명의 정상 저신장 아이들의 IGF-1과 IGF-2를 radio immunoassay한 결과를 분석하였다.

n  GH 결핍 아이들의 18%에서만 나이에 비교해 정상 범위의 serum IGF-1 level

n  반면에, 정상 저신장 아이들은 32%에서 낮은 IGF-1 농도

n  낮은 IGF-2 level 은 GH 결핍 아동 52%에서, 정상 저신장 아동 35%에서 보임

n  결합된 IGF-1/IGF-2 assay 사용은 식별이 더 쉬우나, 소아 내분비학자들에게 일반적으로 사용되는 방법은 아님

- 연구자들은 수많은 정상이지만 저신장인 아이들에게서도 serum IGF-1 또는 IGF-2의 농도가 낮기 때문에, 어떻게 하면 이들과 GHD를 확실하게 구분할 수 있을지에 대해 고민

 

- 최근 Type 2 IGF receptor에 IGF-2 외에도 여러 가지 다른 분자들이 결합한다는 것이 밝혀짐

n   Receptor가 mannose-6-phothate 포함 효소와 부착하는 능력은 세포 환경으로부터 이런 효소를 제거하는 능력에도 매우 중요

 

 

 

6)   IGF receptors

- 1970년대 중반, IGF가 insulin receptor 붙는다는 것이 명확해져, IGF의 insulin-like activity 설명

n  이후 rat에서 insulin과 IGF 각각의 receptor 밝혀짐

n  방사성 IGF를 이용한 연구에서 적어도 2종류 이상의 IGF receptor 있음이 밝혀짐

n  고농도에서 insulin은 IGF receptor에 잘 부착되지만 나머지에서는 거의 붙지 않음

- 이런 receptor에 대한 방법론적 발전에 따라 두 가지 receptor form을 명확히 구분

 

 

- Type 1 IGF receptor:  insulin receptor 와 유사

n  2개 membrane-spanning alpha subunit 및 2개의 intracellular subunit으로 구성된 heterotetramer

n  Alpha subunit: IGF-1 용 binding site 제공

n  Beta subunit: transmembrane domain, ATP-binding site, tyrosine kinase domain(receptor의 signal transduction 기전을 담당하는 것으로 여겨짐)

n  각각의 alpha, beta heterodimer는 ligand에 하나의 분자만 부착할 수 있고, full heterotetrameric receptor는 1mole의 ligand 부착 가능

n  Type 1 IGF receptor가 흔히 “IGF-1 receptor”라 불리지만, 실제 이 receptor는 IGF-1, IGF-2 모두가 높은 정도로 부착가능하며, 이들은 모두 tyrosine kinase를 활성 가능

n  Type 1 receptor 대한 insulin의 친화도는 일반적으로 100배 약하기 때문에 insulin에서 흔히 보이는 mitogenic effect는 상대적으로 작음

n  Ullrich 등은 인간 태반으로부터 복제된 cDNA에서 human type 1 IGF receptor의 1차적인 구조를 밝혀냄

n  성숙형 peptide는 1337개의 아미노산으로 구성(152kd)

n  번역된 alpha-beta heterodimer는 구호 707~710번 위치에서 Arg-Lys-Arg-Arg 순서로 잘리며, 이때 Beta subunit은 지용성 transmembrane domain이자 intracellular tyrosine kinase domain, ATP-binding site 임

n  Insulin과 IGF-1 receptor 모두 동일한 protein에서 유래한 것으로 보이지만

n  Type 1 IGF receptor는 15번 염색체에서, Insulin receptor는 19번 염색체의 gene으로부터 encoding 됨

n  Type 1 IGF receptor는 모든 종류의 세포에서 IGF의 활성을 조절하며, 이런 역할은 다양하며 조직에 특이적(tissue specific)임

- 일반적으로, IGF receptor의 모든 효과는 tyrosine kinase 활성 및 기질의 인산화(특정 cellular pathway를 활성 시켜 다양한 생물학적 기능을 일으키는)로 조절 되다고 여겨짐

n  이런 효과들에는 다음과 같은 것이 있음

n  Cell cycle machinery의 활성 통한 세포 성장 촉진

n  Bcl family로의 효과에 의한 Cell survival 유지(apoptosis 예방)

n  세포 분화의 촉진

-IGF receptor 의해 인산화된 기질은 Insulin receptor 기질의 family를 포함(특히 IRS-1, IRS-2) 

à이 2개 gene을 knockout 시킨 쥐 실험 해보니 성장이 저하되고, insulin 저항성 가짐

n  다른 IRS 분자는 IGF 활성을 조절하는데 negative feedback으로 작용

n  게다가 다른 여러 신호 분자들도 IGF receptor 활성에 반응

n  그래서 cancer therapy로 IGF-1 receptor를 막는 것이 제안(초기 임상 연구에서는 가능성을 보여줌)

- 특히 선충류에서 IGF-1/insulin receptor의 prototype 분자(Daf2로 알려진)는 장수와 연관

à Daf2의 mutation 있는 경우에 선충이 더 오래 생존함

n  선충류에서의 이런 수명 연장은 또한 GH-IGF system의 다른 요소들에서도 보여지며

n  파리나 쥐 등의 다른 동물에서도 그러하다는 것이 알려짐

n  그러나, IGF-1/insulin receptor와 인간의 장수의 연관성은 명확하지 않음

 

- Type 2 IGF-receptor는 insulin이나 type 1 IGF receptor와 구조적 유사성이 없음

n  Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis를 통해, type 2 IGF receptor는 nonreducing condition에서는 220kd, reduction 후에는 250kd를 가지는 monomeric protein으로 밝혀짐

n  복제된 사람의 type 2 R는 271kd의 분자량을 가지며, 긴 extracellular domain 가짐

n  이 receptor는 intrinsic tyrosine kinase domain이나 다른 인식할 수 있는 어떠한 signal transduction 기전도 갖지 않음

n  Type 2 IGF-receptor는 CIM6P(cation-independent mannose-6-phosphate) receptor와 동일한 물질임 밝혀짐

n  CIM6P receptor: 다양한 acid hydrolase와 다른 mannosyslated protein의 intracellular lysosomal targeting에서 발현된 protein

n  이런 receptor 대부분은 intracellular membrane에 위치하며, plasma membrane와 평행상태 유지

n  왜 이런 receptor가 IGF-2와 mannose-6-phosphate-containning lysosomal enzyme에 붙는지는 아직 잘 모름

n  Type 1 IGF-receptor(IGF 1, 2와 모두 잘 붙고, insulin은 100배 낮은 정도로 붙는)와 다르게, type 2 receptor는 오직 IGF-2와만 잘 붙음(IGF-1은 적게라도 결합하지만 insulin은 전혀 결합하지 않음)

n  IGF-2 와 mannose-6-phosphate의 binding site는 receptor의 다른 부위에 결합

n  그럼에도 두 종류의 ligand는 receptor binding에 대해 서로 상호적인 inhibitory effectsà lysosomal enzyme을 분류하는 데 있어서 IGF-2의 잠재적인 효과 의미

 

- 대부분의 연구 의하면 IGF-1, 2의 mitogenic하고 metabolic한 활성이 type 1 IGF receptor의 tyrosine kinase signal transduction 기전에 의해 매개된다고 알려짐

n  Conover, Furlanetto 등에 의하면 type 1 IGF receptor의 IGF-1 binding site에 monoclonal Ab를 위치하자 IGF-1, 2의 thymidine incorporation 및 세포분화를 자극하는 능력이 억제됨

n  유사하게, 다른 여러 그룹의 연구에 따르면 IGF-2 가 type 2 IGF/mannose-6-phosphate 에 붙게 할 수 있는 polyclonal Ab는 IGF-2의 활동을 막지 못함

 

- Type 1 IGF receptor의 IGF-2의 전통적인 IGF 활동을 매개하는 데 있어서의 역할에 대한 더 직접적인 증거는 IGF-2 analogue를 receptor 기능의 probe로 사용하는 데서 알 수 있음.

n  type 1 receptor에 대한 친화도가 감소해 있지만 type 2 receptor에 대한 친화도는 유지하고 있는 IGF-2 analogue는 DNA 합성에 있어서 IGF-2보다 훨씬 약한 효과

n  type 2 receptor가 IGF-2의 mitogenic effect를 매개하지 않는다는 것을 더 지지하는 사실로, 닭이나 개구리의 간 조직에 있는 mannose-6-phosphate receptor가 IGF-2에 붙지 않는 다는 것을 알 수 있음à 이런 종에서의 IGF-2의 mitogenic action은 오직 type 1 IGF receptor에 의해서만 매개되는 것 같음

- 그럼에도, 많은 관찰에 의하면 type 2 IGF receptor를 매개한 IGF-2 활동의 가능성은 여전함

n  Rogers 등에 의하면 type 2 receptor는 개의 신장의 membrane과 proximal tubule에 있는 inositol triphosphate와 diacylglycerol의 생산에 관여한다고 함

n  Tally 등에 의하면 IGF-2는 K562 human erythroleukemia cell line의 subclone 성장을 자극하며, 이것은 IGF-2나 insulin 등에 의해 복제되지 않음

n  Minniti 등에 의하면 IGF-2는 autocrine growth factor 및 사람의 rhabdomyosarcoma cell에서 cell motility factor로 작용할 수 있으면 이런 작용은 type 2 receptor에 의해 매개됨

n  IGF-2는 type 2 IGF receptor를 통해 아마도 pertussis toxin-sensitive guanine nucleotide-binding protein(Gi proteinein)과의 coupling을 통해 calcium-permeable cation channel를 활성시킬 수 있는 것으로 보임

 

 

 

- Type 2 IGF receptor는 IGF-2 뿐 아니라 다른 여러 분자에 붙는 것으로 보임

n  이러한 receptor가 mannose-6-phosphate-containing enzyme(cathepsin이나 urokinase 등)에 붙는 능력은 잘 알려져 있으며

n  그러한 능력 안에서 cellular environment로부터 이러한 enzyme을 제거하므로서, 조직 remodeling을 조절하는 것이 중요함

n  게다가, 연구들에 따르면, type 2 IGF receptor는 retinoic acid에 붙어 retinoids의 성장 억제 효과를 매개함

n  이번 장의 뒤에서 논의될, type 2 IGF receptor의 knockout은 과다성장을 초래

n  이런 receptor는 다양한 anti-mitogenic system을 매개하고 그에 대한 IGF system의 성장억제요소로서 작용함

- 표면상 비정상적인 경쟁적 binding을 우연히 관찰한 결과, variant 또는 비전형적인 insulin과 IGF receptor가 존재가 제안됨 à 한가지 가능한 설명은 insulin receptor에서 1개의 alpha-beta dimer와 type 1 IGF receptor에서 1개의 alpha-beta dimer로 구성된 hybrid receptor의 존재

n  Treadway 등에 의하면 hybrid IGF/insulin receptor에서 ligand-dependent formation이 발견 되었으며

n  Insulin과 type 1 IGF receptor에 specific한 Monoclonal Ab에 관한 연구에서도, 그런 receptor는 세포 내의 충분한 native receptor들과 함께 자연스럽게 발달

n  그러한 hybrid receptor의 생리적 중요성은 잘 밝혀지지 않았음