뭔가 이런 학구적인 주제로 포스팅을 거의 하지 않는데, 지난 학기에 했던 소아과 북리딩 숙제가 그냥 잊기에는 많이 아쉬워서 이곳에 남기기로 했다. 소아과 유교수님의 숙제이기도 했는데 읽다보니 흥미로운 내용이 많고 이 부분은 평소에도 뭔가 중요한듯 하면서도 깊이 파면서 공부할 필요까지는 없는 그런 부분이라 '계륵'으로 여기는 경우가 많았다. 물론 국시에도 안나올 것이고...그럼에도 흥미롭다.
<Disorders of GH/IGF secretion & action Part II>
<Growth Hormone(GH)>
1) 화학구조
- Human GH:
n 아미노산 191개로 구성된 분자량 22-kD의 single chain protein
n Mature form: 당화(Glycosylation)되지 않은 상태로 안에 2개 분자간 이황화결합
- GH는 뇌하수체나 태반에서 생산되는 다른 여러 hormone과 공통 구조식 가짐
n Chorionic somatomammotropin(CS, placentogen)
n 22-kd GH variant(hGH-V)와는 13개의 아미노산만 다름
n GH, prolactin, placental용 geneà 공통 구조를 가지는데,
n 일반적으로 뇌하수체에서 가장 많이 생산되는 GH는 22kd 형태임
2) Secretion
- GH의 특징적인 pulsatile pattern secretion에 관련된 여러 조절자의 상호 작용
n 2가지 hypothalamic regulatory peptideà GHRH, SRIF(somatostatin)
u GHRH(GH-releasing hormone), SRIF(somatotropin release-inhibiting factor)
u GHRH의 아미노산으로 끝나는 말단 부위(tyrosine): GH 분비 자극에 필수적
u GHRH 활성은, 종특이적이며 pituitary somatotrope의 G-protein receptor에 대한 결합의 특이성을 반영
- GHRH 작용 à GH 유전자의 전사 및 분비를 유도
n 크게는 전사적(transcriptionally)으로 조절되며, AC(adenylate cyclase) 자극 및 세포 내 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 를 증가시켜
u 이미 형성된 GH 분비시키고
u GH mRNA의 전사 및 새로운 GH 합성을 증가시킴
n GHRH receptor: G-protein-coupled receptor family B(=secretin family)에 속하며, VIP(vasoactive intestinal polypeptide), secretin, calcitonin, 부갑상선호르몬 등의 receptor 등과 부분적으로 sequence identity를 가짐
n GHRH 분비하는 solid tumor는 GH 과잉의 드문 원인일 수 있음
n GHRH는 미국에서 GH deficiency(GHD)의 치료로 승인되었지만, 치료목적으로의 사용은 시장에서는 철회되고 현재 진단 목적으로 사용되며, 특히 성인 GH deficiency를 확인하는데 사용됨
- Somatostatin 작용 à GH의 기저치와 GH의 파동 횟수 및 진폭을 억제
n GH 합성보다는, pulsatile한 GH 분비의 타이밍과 진폭 크기(amplitude)에 연관
n Somatostatin(성장호르몬 분비 억제하는 호르몬)이 특정 receptor에 붙으면
u AC 활성의 억제 및 세포 내 Ca 농도 감소 효과
u 배양한 GHRH과 somatostatin을 가진 somatotropic cell 치료 à 새포 내 Ca 농도 감소와 함께 GH 분비 억제하며 강한 somatostatin 효과 보임
n 생체 내 GH의 pulsatile secretion은 hypothalamic somatostatin 분비의 지속적 감소 및 GHRH 활성 증가에 기인한 것으로 여겨짐
n GH 분비 저하(trough): GHRH 활성 감소상태 + somatostatin 분비 증가시 발생
n Somatostain analogue:
u acromegaly 등 치료에 사용(GH secretion inhibitor로서의 역할은 과소평가됨)
- GHRH와 somatostatin의 상호 분비 작용 조절은 신경학적으로 완전히 이해되지는 않음
n Serotonin, histamine, NE, dopamine, Ach, GABA, TRH, VIP, gastrin, neurotensin, substance P, calcitonin, neuropeptide Y, vasopressin, CRH, galanin 등 많은 neurotransmitter와 neuropeptide가 이런 hypothalamic factor의 분비 조절에 연관
n 이런 요인들은 다양한 생리적 상황(스트레스, 수면, 출혈, 금식, 저혈당, 운동 등)에서 관찰되는 GH의 분비 변화와 밀접하게 연관되며, GH 분비 용량/저장량(GH secretory capacity/reserve)을 평가할 때 얼마나 많이 GH-자극 검사를 해야 하는지에 대한 기초 자료 제시
- GH 분비는 또한 androgen, estrogen, thyroxine, glucocorticoid 등 다양한 non-peptide hormone에 의해 영향 받음
n GH 분비를 조절하는 이런 호르몬들의 정확한 기전은 복잡,
u 잠재적으로 hypothalamus와 pituitary level에서의 활성과 연관
u 임상적으로, 갑상선기능저하증과 glucocorticoid 과잉은 각각 자발적인 GH 분비나 유발되는 GH 분비 감소시킴(즉 GH testing 앞서 반드시 치료 해야 함)
u 사춘기 시작 때나 약으로 주입된 경우에 있어, Sex steroid는 사춘기의 특징적인 GH 분비 증가의 원인으로 여겨짐
- GH-releasing peptide(GHRPs): GH 분비를 자극할 수 있는 합성 hexa-peptide 발명됨
n 나중에 gastric hormone인 ghrelin의 analogue로 여겨진 GHRPs는
u 직접 GH 분비를 자극할 수 있고
u GHRH에 대한 GH의 반응을 증강시킬 수 있음
n GHRPs 장점:
u 경구투여 가능
u pituitary가 intact한 환자에 있어 GH 분비를 크게 증강
n GHRPs 지속 투여시à GH pulse의 진폭크기(amplitude)는 유의하게 증가
n GHS-R(GH secretagogue, 성장호르몬 분비촉진제 - receptor):
u GH-releasing 물질에 대한 공통된 receptor (주로 Ghrelin-mimetic ligands 사용)
u GHS-R은 GHRH receptor와는 다름
l GHS-R gene을 복제 결과à unique한 G-protein-coupled receptor를 나타남
l 사람, 쥐와 96% 동일한 protein sequence를 가짐
l 3가지 isotype 갖는 receptor가 인간 게놈 library에서 동정
à이 receptor 돌연변이 à 다양한 정도의 GH insufficiency 및 저신장 초래
n Ghrelin
u 28개 아미노산으로 이뤄진 peptide
u hypothalamus, stomach 등에서 발견되며, GHS-R용 endogenous ligand로 밝혀짐
u 정상 기능을 하기 위해선 Acetylation이 되어야 함
u 동물 실험에서 IV, intracerebroventricular, intraperitoneal로 ghrelin 투여 결과
l 음식 섭취를 자극하여 비만을 초래
l plasma의 GH 농도를 올리는 효과
l but, ACTH(Adrenocorticotropic hormone) level은 상대적으로 덜 상승
u Ghrelin receptor mutationà ISS(idiopathic short stature)의 가능한 원인 중 하나
u 즉, Ghrelinà 성장 및 대사 위한 영양분 분배 있어 중요한 자극원, GH 조절 시스템의 핵심 요소임
n Obstatin: Ghrelin과 같은 유전자에서 encoding 되는 2번째 peptide
u GH 분비 조절은 하지 않고, 체중 조절에 관여
- Pituitary-specific한 전사인자의 이상은 유전적 저신장을 유발
n POU1F1(Pit-1): somatotropes, lactotropes, thyrotropes 의 발달조정에 관여
u 즉 POU1F1 발현 이상은 GH, TSH, PRL 등 다양한 pituitary deficiency와 관련
u POU1F1 gene 돌연변이는 유전적인 multiple pituitary hormone deficiency 관련
- GH 합성 및 분비는 또한 IGF(insulin-like growth factor) peptide 의한 feedback 의해 조절
n IGF receptor는 pituitary에서 발견됨
u IGF-1 의한 GH 분비 억제 실험은 여러 장기(system)에서 시행
u Recombinant IGF-1의 subcutaneous injection 받은 환자에 있어 자연적인 GH 분비 억제에 대한 실험도 시행
n 임신 1분기 말에 태아의 serum에서 GH 확인됨
u GH level은 만삭인 영아가 조산아보다 더 낮은데à gestation의 후기 stage의 특징적인 IGF peptide 혈중치 상승에 의한 feedback 작용 때문으로 보임
- 청소년기에 GH 분비가 peak을 이루는 것은, 사춘기 때 IGF-1 혈중 수치가 매우 높아지는 것에 기여함
n GH 분비는 청소년기 후기 때 감소하기 시작하며, 성인기를 통해 지소적 감소
n 사춘기는 “acromegaly” 시기를 어느 정도 보일 수 있다는 것을 고려해야 하고
n 반면 노화(aging)은 특징적인 GH 분비 감소와 더불어 somatopause라 칭해짐
- 성인 남자에서 정상인 24시간 GH 생산 속도(rate)는 0.25~0.52 mg/m2 임
n 그러나 노화를 포함한 많은 생리적인 상태가 GH 분비에 영향
u 수면 단계, 영양 상태, 갑작스런 금식, 운동, 스트레스, 성호르몬 등
u Ho 등에 따르면, serum estradiol 농도가 GH 분비에 가장 중요한 요소라고 함
l Estradiol을 분석에서 제거한다면, 나이와 성별은 GH의 종합적인 혈중 수치에 크게 영향 미치지 않음
u Testosterone의 혈중 IGF-1 농도에 대한 효과는 적어도 GH와의 관련에서 부분적으로 독립적임à GH receptor에 돌연변이를 가진 사람은 사춘기 시절에도 여전히 IGF-1 level 상승을 경험함
- GH 분비의 pulsatile한 성질은 잦은 serum sampling을 통해서도 알 수 있음(특히 sensitive한 GH assay와 함께 검사하면 더 두드러짐)
n 정상 상태와 GH burst 사이 혈중 GH 농도는 0.2 ng/mL 미만임
n 즉 Random한 serum sampling으로 GH 분비 평가한다는 것à 유용하지 못함
- 최대 GH 분비는 밤에 발생, 특히 첫번째 slow-wave sleep(stage 3, 4)에 발생
n 반면 REM sleep은 낮은 GH 분비와 연관
- 정상 젊은 남자는 일반적으로 24시간 동안 12번의 GH secretory burst를 겪음
- 비만은 감소된 회수의 GH burst에 따른 GH 분비 억제로 특징되어짐
- 금식은 GH secretory burst의 회수와 정도를 증가시키며, 감소된 somatostatin 분비 반영함
- GH의 pulsatile secretory한 특징이 생물학적 활성에 어떤 영향을 미치는지는 아직 미지수
3) GHR(GH Receptor)/GHBP(GH-binding protein)
- GH Receptor: 638개 아미노산으로 합성, 후에 620개 아미노산 가진 성숙형 receptor, glycosylation 전에 70kDa의 분자량 가짐
- 세포 밖 hormone-binding domain: 246개 아미노산으로 구성
n 인간의 circulating GH-binding protein(GHBP)
u Receptor의 세포 밖 domain이 잘려나 나가 순환하는 것에서 유래
- 사람 GHR gene: 염색체 5p13.1-p12에 위치하며 87kb까지 확장됨
n 반면 mouse, rat은 여러 종류의 transcript 발견됨
- Human GHR의 coding region 및 3’-untranslated region은 9개의 exon(2~10번)으로 encoding 됨
n Exon 2: signal peptide 분비
n Exon 3~7: extracellular domain을 encoding
n Exon 8: transmembrane domain을 encoding
n Exon 9: intracellular domain encoding
n Exon 10: 3’-untranslated domain encoding
n GHR의 exon 3는 정상 개인에 비해 상당히 많이 제거되어 있기도 한데(delta-3 GHR polymorphism), 이것이 모두 GH에 대한 반응을 결정하거나 출생 사이즈, 생후 성장 등과 연관이 있는 것은 아님
- GHR은 prolactin receptor와 매우 유사하며, erythropoietin, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, interferon, interleukin 등의 receptor와 sequence를 공유(GHR은 class 1 hematopoietic cytokine family의 일종)
n 최근 GH와 GHBP 분자 complex에 대한 이해가 GH 단독 연구에 비해 더 효율적임 밝혀짐à 생리학적으로 GHBP의 치료 역할에 대한 것
n GH-GHR complex에 대한 결정 구조에 대한 연구는, complex가 GH 한 분자가 2개의 GHR 분자에 부착되어 있음을 밝혔으며 이것은 GH action에 필요한 GH-induced receptor dimerization을 의미
n 흥미로운 것은, 유전적으로 합친 GH와 GHR complex는 최근 GH 단독으로 실험했을 때 보다 효율이 더 증가하고 반감기가 극적으로 길어졌음이 밝혀짐
- GH는 receptor에 붙어 receptor dimerization 유도 후, 120kd의 protein의 인산화를 자극함
n JAK2(Janus kinase 2): 주요한 GHR 관련 tyrosine kinase로, GH action 관련
u GH가 membrane-associated GHR에 붙어 à GHR을 dimerazation 시키고 à GHR과 JAK2를 interaction 시켜 à JAK2와 GHR에 tyrosine을 phosphorylation 시킨 뒤에 ànuclear protein을 phosphorylation과 dephosphorylation 시킨 후à target gene transcription을 자극하는 것
u GHR 그 자체로는 내재된 kinase 활성이 없으며, 2개의 JAK2 분자가 dimerized GHR에 의해 함께 위치하는 것이 각각의 JAK2가 transphosphorylation 되어 결국 JAK2를 활성 시킴
u 활성화된 JAK2는 여러 tyrosine site에서 GHR을 인산화 시킴
n GH와 JAK2에 의존적인 인산화 및 활성화는 다양한 STAT(signal transducer and transcription activator)에 의해 진행됨: STAT1, STAT3, STAT5
u 이런 세포 내 protein 들은 homodimer나 heterodimer를 형성 한 후 à nucleus로 translocation한 뒤 DNA에 붙어서 전사를 활성시킴
n 다른 GH-activated pathway: MAPKs, ERK-1, ERK-2, insulin-signaling path, PKC 등
n 이런 pathway에서 GH의 다양한 동화 및 대사 작용은 다음과 같음
- 체내 GHBP: GH와 높은 특이도 specificity 및 친화력 affinity, but 상대적으로 낮은 용량
n GHBP는 GHR의 extracellular domain의 중요 요소이며 약 55kDa의 무게 가짐
u GHBP에 대한 첫번째 assay는 serum에서 125-I-GH를 배양하고 gel filtration, 고압 liquid chromatography, dextran-coated charcoal 등을 통해 free radioligand로부터 분리 시키는 것임
u Carlsson 등은 ligand-mediated immunofunctional assay(LIFA) 발명: GH에 붙을 수 있는 GHBP 측정
u GHBP의 혈중 농도를 측정하는 assayà GHR의 유전적 기형에 의한 GH insensitivity(GHI) 환자를 확인하는데 사용, but GHI 환자 중
l GH receptor가 없거나
l GHR의 intracellular 부분에 문제가 있거나
l dimerize가 안되는 문제가 있는 경우에 있어서는 GHBP는 정상 수치
- 여러 GH-inducible suppressor of cytokine signaling(SOCS) 의한 GH signaling의 억제
n 거대증을 보인 SOCS-2 knockout mouse(특정유전자 제거한 쥐)에서 성장을 조절하는데 중요한 SOCS protein의 중요성에 대한 증거 발견
n 반면 SOC가 overexpression 되었을 경우 signal transducer인 STAT4와 STAT5-dependent 한 전사활성에 대한 GH 활성이 완전 억제
n SOC는 JAK2의 GHR-dependent tyrosine phosphorylation을 억제함
n IL-1b나 TNFa 등의 endotoxin 및 proinflammtory cytokine은 GH resistance를 유발
u 이런 모든 agent는 또한 SOC protein을 유발 가능 à IL-1b나 TNFa 또는 생체 내 endotoxin 등 의해 유발된 SOCS-3는 sepsis에 의해 유발된 GH resistance 유발에 중요 작용
u 한편 GH 치료를 받고 septic shock 빠진 환자는 사망률이 올라가며, 이것은 sepsis의 결과 특정 조직에 GH resistance가 유발된 것과 관련
u 즉, intracellular GH signaling antagonist인 SOCS protein의 역할은 다양한 병태생리 상황에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 여겨짐
4) GH Actions à 성장효과 & 대사작용
- ‘Somatomedin hypothesis’에 의하면, GH의 동화 작용은 IGF peptide에 의해 매개됨
n Somatomedin =IGF-I
n 이 가설은 대부분 맞는 말이지만, GH의 다양한 자극 작용은 IGF 활성과는 무관
n 게다가, GH와 IGF의 효과는 어떤 면에서는 모순됨
u GH의 “당뇨병 유발적(diabetogenic)” 작용 Vs IGF의 혈당을 낮추는 효과
u GH는 세포 내로의 포도당 섭취를 줄여 당뇨병 유발적인 작용을 함
- 이런 차이점 해결 하고자, Green 등은 ‘이중 작용자 모델(dual effector model)’ 연구
n GH가 prechondrocyte 같은 전구 물질을 분화 하도록 자극à 분화된 cell과 주위 cell 들이 IGF를 분비à 이런 peptide는 분열촉진 물질(mitogen)로 작용 à 클론증식(clonal expansion)을 자극함
n 이런 가설은 IGF peptide가 혈관을 통해 운반되는 전통적인 내분비 요소일 뿐 아니라 paracrine이나 autocrine growth factor로서도 작용을 한다는 것에 기반함
- GH는 또한 다양한 대사 작용을 자극하는데 이것은 IGF 생산과 독립적으로 발생함
u Lipolysis: 지방 조직으로부터 지방산 동원 증가
u 횡경막과 심장에서의 아미노산 이동: IGF-1을 매개로 아미노산 섭취를 증가
u 특정 간 단백질의 생산 등: mRNA의 전사 해독을 직접 향상시켜 단백합성 증가
n 또, GH 작용하는 다양한 site 있으며, 흔히 이것은 IGF system에 의해 이뤄진다고 명확하게 밝혀지지 않으며(GH의 IGF-independent effect 의미) 이런 site의 예로는
u Epiphysis: 골단(epiphyseal) 성장을 자극
u Bone: 파골세포(Osteoclast) 분화 및 활성 자극, 골모세포(osteoblast) 활성 자극, 연골 내 골화작용 촉진(endochondral bone formation 통해 bone mass 증가)
l Lupu 등은 IGF-I를 완전 Knockout 시킨 쥐가 GHR knockout 시킨 군에 비해 훨씬 작아진다는 것을 통해 GH의 성장에 있어 IGF-independent한 효과를 밝힘
u Adipose tissue: acute insulin-like effect 가짐(=지방분해 증가, lipoprotein lipase 억제, hormone sensitive lipase 자극, 감소된 glucose 이동, 지방형성 억제)
u Muscle: 아미노산 운반 증가, 질소 저장 증가, 근육 동화작용, 에너지 소비 증가
l IGF-independent한 GH 작용을 지지해 주는 생체 내 실험: GH의 모든 효과를 IGF-1이 할 수는 없었음(nitrogen retention이나 insulin resistance 등)
n 노화 및 이화작용에 있어 GH의 효과는 현재 연구 중
<Insulin-like Growth Factors(IGF)>
1) 역사적 배경
- IGF(=somatomedin)는 적어도 어느 정도는 GH-dependent 하며, GH의 많은 동화작용 및 유사분열 촉진 작용(mitogenic)에 매개 역할을 한다고 여겨지는 물질
n 지난 45년간 다양한 대사 활동에 대한 것이 밝혀짐
- 1957년, Salmon과 Daughaday, pituitary 제거 쥐에서 나온 serum이 쥐의 chondrocyte proteineoglycan을 형성하기 위한 황산염 결합을 촉진시키는 능력이 GH의 ‘추가’에 의해 복구될 수 없음을 밝힘
n 그러나, 황산염 결합 촉진 능력은 pituitary를 제거한 뒤 GH로 치료 받은 쥐에서 나온 serum을 추가함으로서 회복될 수 있음 à 즉 GH-dependent “황산화인자(sulfation factor)”의 존재를 밝힘
- 쥐의 근육과 지방세포에서 insulin 작용에 대한 연구에 따르면
n 정상 serum에서 아주 적은 양의 insulin-like activity는 anti-insulin antibody의 첨가의해 방지 가능 à but 이때 남은 작용은 NSILA(nonsuppresssible insulin-like activity)라 하며 이것은 수용성인 7 kd 형태(NSILA-I, NSILA-II)
- Dulak과 Temin은 소의 serum에서 mitogenic 성질을 연구
n Fetal buffalo rat의 간세포에서 얻은 media(BRL-3A)는 배양된 세포의 성장을 도와주는 것으로 밝혀졌으며, media의 mitogenic factor는 MSA(multiplication-stimulating activity)라 불리며, sulfation factor 및 NSILA와 함께 대사 및 유사분열 촉진 작용(metabolic and mitogenic activity)을 공유하는 것으로 알려짐
- 1972년, sulfation factor 와 NSILA는 SM(somatomedin)이란 이름으로 불리게 됨
n SM의 특성:
u 혈중 농도는 반드시 GH dependent하며
u 골격 외 조직(extraskeletal tissue)에서 insulin-like activity를 가지고
u 연골에서 황산염(Sulfate)의 cartilage로의 결합(incorporation)을 촉진하며
u DNA 합성 및 세포의 증식 촉진함
n 이러한 것을 정제하려는 노력은 2개의 somatomedin peptide를 생산
u SM-C: basic peptide
u SM-A: neutral peptide
- 1978년, Rinderknecht와 Humbel은 proinsulin과 구조적으로 매우 유사한 2개의 활성 somatomedin을 사람의 혈장에서 동정하는데 성공à 따라서 이 2개는 IGFs(insulin-like growth factor)로 다시 이름을 바꿈
2) IGF 구조 및 분자생물학
- IGF-1, 2는 구조적으로 유사하며 73개의 가능한 아미노산 위치에서 45개를 공유
n IGF-1: SM-C와 관련된 basic peptide가 70개 아미노산으로 구성
n IGF-2: 약간 산성의 peptide로 67개의 아미노산으로 구성
- 그리고 이들이 가진 아미노산 중 약 50%는 insulin과 유사성 보임
n Insulin과 같이, IGF-1, 2 모두 disulfide bond로 연결된 A, B chain을 가짐
n 반면 connecting region(C-peptide)는 IGF-1은 12개, IGF-2는 8개 아미노산을 가지며 proinsulin의 C-peptide region과는 다름(carboxyl-terminal extensino인 D-peptide도 각각 8, 6개의 아미노산을 가지므로 proinsulin과 다름)
n 이런 구조적 유사성은
u IGF 1, 2가 insulin receptor에 붙는 능력이 있다는 것과
u Insulin이 type 1 IGF receptor에 붙을 수 있다는 것을 설명해 줌
u 반대로, 구조적 차이점은 insulin이 IGF-binding protein에 붙지 못하는 것을 설명
- 2가지 다른 형태의 IGF-1 전구 분자가 발견됨: IGF-1A, IGF-1B
n 70개 아미노산으로 구성된 Signal peptide, 48개 아미노산으로 된 mature IGF-1 분자, 전구체 E domain의 첫 16개 아미노산으로 구성된 첫 134개 아미노산은 동일
n IGF-1A는 19개, 1B는 61개의 아미노산이 추가
- IGF-1 gene의 Alternative splicing은 2가지 종류의 messenger RNA(mRNA)를 생성
n 사람과 쥐에서의 주요한 IGF-2 translation 생산물은 24개 아미노산으로 구성된 잔여 signal peptide 및 67개 아미노산으로 이뤄진 mature IGF-2 sequence와 89개 아미노산으로 된 carboxyl-terminal E-peptide로 된 180개 아미노산을 가짐
- IGF gene expression의 조절은 복잡하며, 여러 조직에서 뿐 아니라 배아, 태아, 소아 및 성인에서의 발현 정도가 다름
n IGF-1,2: 하나의 gene에서 encoding, 각각 95, 35kb의 genomic DNA로 spanning 됨
n 인간의 IGF-1 gene은 12번 염색체의 장완에 위치하며 IGF-1 gene은 적어도 6개의 exon을 가짐
u Exon1,2: alternative signal peptide encode
u Exon3, 4: 남은 signal peptide, mature IGF-1 나머지, trailer peptide 일부 encode
u Exon5,6: 39개 untranslated sequence 및 대신 사용되어진 IGF-1A 및 IGF-1B form이 되는 trailer peptide를 encode
n 인간 IGF-2 gene은 11번 염색체 단완에 위치하며, insulin gene과 가깝고, 9개 exon을 가진 35 kb의 genomic DNA로 spanning 됨
u Exon 1~6: 다양한 promoter site를 포함한 59개 untranslated RNA를 encode
u Exon 7: signal peptide와 대부분의 mature protein encode
u Exon 8: protein의 carboxyl-terminal 부위 및 coding이 exon 9에서 끝나는 trailer peptide를 encode
n 이러한 결과 다양한 mRNA 종이 IGF-1 과 IGF-2에 존재à 이것은 유전자 발현 조절을 매우 복잡하게 하였고, 개체발생 조절 및 호르몬 조절 뿐 아니라 특정 transcript의 tissue-specific expression을 가능하게 함
3) IGF peptides assay 방법론
- 1957년 IGF peptides를 처음 동정한 후, 정확한 측정을 하는 것은 매우 어려운 일임이 밝혀짐.
n Bioassay 방법이 어려운 이유
u serum 내에 존재하는 유사물질과 IGF action을 방해물질 의해 종종 영향 받게 됨
u 더 중요한 것은 모든 assay 는 IGF binding proteins(IGFBPs)의 존재에 영향을 받게 됨(IGFBPs는 모든 biologic fluid내에 존재)
- bioassay 방법
n stimulation of 〔35S〕sulfate incorporation(황산염결합 자극)
u Salmon과 Daughaday에 의해 기술된 original 방법. 다양하게 변형된 방법도 사용됨
(예: Stimulation of DNA synthesis, RNA synthesis, protein synthesis, glucose uptake등)
u 단점: IGFBPs의 방해를 받게 되며, IGF-1과 IGF-2를 구별 할 수 없음
n Radio receptor assay, Competitive protein binding assays 개발
u 장점: specific Ab를 이용해 IGF-1과 IGF-2를 정확히 구별해서 측정 가능
n Double antibody sandwich assay방법: specific Ab 사용
u 장점: ELISA 같은 방법으로 정확도와 재현성 높음
u 단점: 여전히 IGFBPs의 문제는 어떤 IGF assay에서도 해결되지 않고 있음
예) uremic sera assay for IGF, Radio receptor assay, radioimmunoassay 모두 IGFBPs 영향 받고, Ab를 이용한 방법조차도 IGFBPs영향 받음
- 일반적으로 IGF peptides와 IGFBPs를 분리하는 가장 효율적인 방법
n 산성 환경하에서 sizing chromatography 이용
u IGF-1, IGF-2 분자량: 7 kd Vs IGFBPs 분자량: 25 ~ 45 kd
u 단점: 비록 이 방법이 대부분의 serum sample들에서 효과, but IGFBP/IGF peptide ratio 높은(신생아, GHD, uremia 등) 상태의 cell line과 serum에서 효과 좋지 않음
- 대체적인 방법
n IGF-1, IGF-2의 C-peptide region 같은 종합 peptide에 작용하는 Ab 이용
u 단점: 이런 Ab는 특이도는 높지만 친화도가 상대적으로 낮음
u But, radio labeled peptide는 endogenous IGFPs에 결합하지 않는다는 장점
- 현재 IGF assay 중 가장 정확하고 효과적인 방법
n Enzyme linked immune sorbent assay(ELISA), Immunoradiometric assay
u sandwich assay와 유사한 방법을 사용해 IGFBPs의 간섭을 최소화 하는 방법
u 장점: Radio labeled IGF 분자를 사용하지 않음
n Radio labeled IGF 분자: IGFBPs에 결합 가능à 이것으로 인해 IGFBPs가 높을 때 결과오류가 생길 수 있기 때문
4) Serum Peptide level of IGF
- serum IGF-1 level 나이에 따른 변화
n 태아 serum IGF-1 level: 상대적으로 낮고, 재태 연령과 관련해 양적 상관관계가 있다.
태아 탯줄 serum IGF-1 level과 출생체중의 관계에 대한 연구 중 몇몇 연구는 상관관계가 있다고 보고, but 일부 다른 연구는 상관관계가 없다고 보고
n 신생아 serum IGF-1 level: 일반적으로 성인 level의 30~50%정도
n 유년기를 거치면서 serum 농도가 점점 증가해, 성적 성숙이 시작될 때 성인 level 도달
n 사춘기가 진행하는 동안, IGF-1 농도가 성인 보다 2~3배 농도로 상승
u 사춘기 동안 농도: 역연령(chronologic age)보다 Tenner stage(뼈 연령)와 상관관계
u Gonadal dysgenesis가 있는 소녀: 사춘기 때 serum IGF-1 상승을 보이지 않는 것을 보아, sex steroids 생성이 사춘기 때 IGF-1 상승과 관련이 있는 것이 확실
l Sex steroid와 간접적 관계: Sex steroids가 사춘기 때 상승하면 à GH 분비를 유도해 à IGF-1 생성에 간접적인 영향
l Sex steroids와 직접적 관계: GHR maturation으로 인한 GHI가 있는 환자는 GH level이 감소 했음에도 불구하고 사춘기 때 serum IGF-1이 상승à 따라서 IGF-1에 sex steroids가 직접 연관되어 있을 것이라 생각됨
n 사춘기 후, 최소한 20,30대가 되면 serum IGF-1 농도는 점차 나이와 관련해 감소
u 원인: 음성 질소 평형, 몸의 근육 감소, 나이에 따른 osteoporosis 관련
u 비록 아직까지 ‘provocative 가설’ 증명되진 않았지만, 정상 연령에 따른 GH+ IGF-1 치료의 잠재적 사용에 관심
- serum IGF-2 level 나이에 따른 변화
n 신생아의 IGF-2 level 은 일반적으로 성인 level 의 50% 정도
n 하지만 1세 때, 농도가 감소하여 7~8세 때 신상아 때 수치로 서서히 되돌아 옴
n 사람의 이런 IGF-2 농도 변화: rat, mouse와는 완전히 다른 패턴
n Rat, mouse serum IGF-2 level: fetus때 가장 높고 출생 후 점점 감소해 adult때는 거의 측정되지 않음
5) 성장 장애에서 IGF level 측정
- IGFs의 GH 의존에 대한 연구가 Salmon과 Daughaday에 의해 최초로 발표
n Radio immunoassays의 민감도와 특이도가 발전함에 따라 IGF-1과 IGF-2의 구별도 가능해져, GH 상태에 따른 serum IGF level의 관련성에 대해서도 연구 중
u 각각의 IGF peptide를 개별적으로 측정하는 것의 장점: IGF-1 농도는 IGF-2 농도에 비해 더 GH 의존적이며, GH 분비 패턴의 변화를 밝혀내는데 유용하다.
u 하지만 Serum IGF의 농도는 역연령, 성 성숙 정도, 영양상태에 큰 영향을 받음
n 결과적으로 나이에 맞는 정상 수치를 설정하는 것이 중요
n 5살 미만의 정상 소아: IGF-1 level 매우 낮기 때문에 정상 범위와 GH deficient children의 수치가 상당부분 일치하므로 감별에 주의
- Ranke 등은 키가 5th percentile 미만의 아이들 400명에게서 GH stimulation test 시행
n IGF-1의 수치를 측정함으로써 GHD(Growth hormone deficiency) 진단을 대신
n Standard provocative test를 통해 GH 결핍을 진단 받은 아이들은 매우 낮은 IGF-1 level
n But, GH 결핍 환자와 저신장이지만 GH level 정상인 아이들à serum IGF-1 level 상당 부분 일치
n 뼈연령이 12세 이상인 아이들에 한해서만 serum IGF-1 level로 GHD와 정상 저신장 아이들 확실하게 구별 가능
- 유사하게 Rose 등은 낮은 provocative GH 또는 낮은 overnight GH 농도를 가진 아이들이 serum IGF-1농도가 낮기는 하지만 정상 GH농도를 가진 아이들과 비교했을 때 극적으로 낮지는 않다는 것을 밝힘
- Rosenfeld 등은 68명의 GHD 아이들과, 197명의 정상 신장 아이들, 44명의 정상 저신장 아이들의 IGF-1과 IGF-2를 radio immunoassay한 결과를 분석하였다.
n GH 결핍 아이들의 18%에서만 나이에 비교해 정상 범위의 serum IGF-1 level
n 반면에, 정상 저신장 아이들은 32%에서 낮은 IGF-1 농도
n 낮은 IGF-2 level 은 GH 결핍 아동 52%에서, 정상 저신장 아동 35%에서 보임
n 결합된 IGF-1/IGF-2 assay 사용은 식별이 더 쉬우나, 소아 내분비학자들에게 일반적으로 사용되는 방법은 아님
- 연구자들은 수많은 정상이지만 저신장인 아이들에게서도 serum IGF-1 또는 IGF-2의 농도가 낮기 때문에, 어떻게 하면 이들과 GHD를 확실하게 구분할 수 있을지에 대해 고민
- 최근 Type 2 IGF receptor에 IGF-2 외에도 여러 가지 다른 분자들이 결합한다는 것이 밝혀짐
n Receptor가 mannose-6-phothate 포함 효소와 부착하는 능력은 세포 환경으로부터 이런 효소를 제거하는 능력에도 매우 중요
6) IGF receptors
- 1970년대 중반, IGF가 insulin receptor 붙는다는 것이 명확해져, IGF의 insulin-like activity 설명
n 이후 rat에서 insulin과 IGF 각각의 receptor 밝혀짐
n 방사성 IGF를 이용한 연구에서 적어도 2종류 이상의 IGF receptor 있음이 밝혀짐
n 고농도에서 insulin은 IGF receptor에 잘 부착되지만 나머지에서는 거의 붙지 않음
- 이런 receptor에 대한 방법론적 발전에 따라 두 가지 receptor form을 명확히 구분
- Type 1 IGF receptor: insulin receptor 와 유사
n 2개 membrane-spanning alpha subunit 및 2개의 intracellular subunit으로 구성된 heterotetramer
n Alpha subunit: IGF-1 용 binding site 제공
n Beta subunit: transmembrane domain, ATP-binding site, tyrosine kinase domain(receptor의 signal transduction 기전을 담당하는 것으로 여겨짐)
n 각각의 alpha, beta heterodimer는 ligand에 하나의 분자만 부착할 수 있고, full heterotetrameric receptor는 1mole의 ligand 부착 가능
n Type 1 IGF receptor가 흔히 “IGF-1 receptor”라 불리지만, 실제 이 receptor는 IGF-1, IGF-2 모두가 높은 정도로 부착가능하며, 이들은 모두 tyrosine kinase를 활성 가능
n Type 1 receptor 대한 insulin의 친화도는 일반적으로 100배 약하기 때문에 insulin에서 흔히 보이는 mitogenic effect는 상대적으로 작음
n Ullrich 등은 인간 태반으로부터 복제된 cDNA에서 human type 1 IGF receptor의 1차적인 구조를 밝혀냄
n 성숙형 peptide는 1337개의 아미노산으로 구성(152kd)
n 번역된 alpha-beta heterodimer는 구호 707~710번 위치에서 Arg-Lys-Arg-Arg 순서로 잘리며, 이때 Beta subunit은 지용성 transmembrane domain이자 intracellular tyrosine kinase domain, ATP-binding site 임
n Insulin과 IGF-1 receptor 모두 동일한 protein에서 유래한 것으로 보이지만
n Type 1 IGF receptor는 15번 염색체에서, Insulin receptor는 19번 염색체의 gene으로부터 encoding 됨
n Type 1 IGF receptor는 모든 종류의 세포에서 IGF의 활성을 조절하며, 이런 역할은 다양하며 조직에 특이적(tissue specific)임
- 일반적으로, IGF receptor의 모든 효과는 tyrosine kinase 활성 및 기질의 인산화(특정 cellular pathway를 활성 시켜 다양한 생물학적 기능을 일으키는)로 조절 되다고 여겨짐
n 이런 효과들에는 다음과 같은 것이 있음
n Cell cycle machinery의 활성 통한 세포 성장 촉진
n Bcl family로의 효과에 의한 Cell survival 유지(apoptosis 예방)
n 세포 분화의 촉진
-IGF receptor 의해 인산화된 기질은 Insulin receptor 기질의 family를 포함(특히 IRS-1, IRS-2)
à이 2개 gene을 knockout 시킨 쥐 실험 해보니 성장이 저하되고, insulin 저항성 가짐
n 다른 IRS 분자는 IGF 활성을 조절하는데 negative feedback으로 작용
n 게다가 다른 여러 신호 분자들도 IGF receptor 활성에 반응
n 그래서 cancer therapy로 IGF-1 receptor를 막는 것이 제안(초기 임상 연구에서는 가능성을 보여줌)
- 특히 선충류에서 IGF-1/insulin receptor의 prototype 분자(Daf2로 알려진)는 장수와 연관
à Daf2의 mutation 있는 경우에 선충이 더 오래 생존함
n 선충류에서의 이런 수명 연장은 또한 GH-IGF system의 다른 요소들에서도 보여지며
n 파리나 쥐 등의 다른 동물에서도 그러하다는 것이 알려짐
n 그러나, IGF-1/insulin receptor와 인간의 장수의 연관성은 명확하지 않음
- Type 2 IGF-receptor는 insulin이나 type 1 IGF receptor와 구조적 유사성이 없음
n Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis를 통해, type 2 IGF receptor는 nonreducing condition에서는 220kd, reduction 후에는 250kd를 가지는 monomeric protein으로 밝혀짐
n 복제된 사람의 type 2 R는 271kd의 분자량을 가지며, 긴 extracellular domain 가짐
n 이 receptor는 intrinsic tyrosine kinase domain이나 다른 인식할 수 있는 어떠한 signal transduction 기전도 갖지 않음
n Type 2 IGF-receptor는 CIM6P(cation-independent mannose-6-phosphate) receptor와 동일한 물질임 밝혀짐
n CIM6P receptor: 다양한 acid hydrolase와 다른 mannosyslated protein의 intracellular lysosomal targeting에서 발현된 protein
n 이런 receptor 대부분은 intracellular membrane에 위치하며, plasma membrane와 평행상태 유지
n 왜 이런 receptor가 IGF-2와 mannose-6-phosphate-containning lysosomal enzyme에 붙는지는 아직 잘 모름
n Type 1 IGF-receptor(IGF 1, 2와 모두 잘 붙고, insulin은 100배 낮은 정도로 붙는)와 다르게, type 2 receptor는 오직 IGF-2와만 잘 붙음(IGF-1은 적게라도 결합하지만 insulin은 전혀 결합하지 않음)
n IGF-2 와 mannose-6-phosphate의 binding site는 receptor의 다른 부위에 결합
n 그럼에도 두 종류의 ligand는 receptor binding에 대해 서로 상호적인 inhibitory effectsà lysosomal enzyme을 분류하는 데 있어서 IGF-2의 잠재적인 효과 의미
- 대부분의 연구 의하면 IGF-1, 2의 mitogenic하고 metabolic한 활성이 type 1 IGF receptor의 tyrosine kinase signal transduction 기전에 의해 매개된다고 알려짐
n Conover, Furlanetto 등에 의하면 type 1 IGF receptor의 IGF-1 binding site에 monoclonal Ab를 위치하자 IGF-1, 2의 thymidine incorporation 및 세포분화를 자극하는 능력이 억제됨
n 유사하게, 다른 여러 그룹의 연구에 따르면 IGF-2 가 type 2 IGF/mannose-6-phosphate 에 붙게 할 수 있는 polyclonal Ab는 IGF-2의 활동을 막지 못함
- Type 1 IGF receptor의 IGF-2의 전통적인 IGF 활동을 매개하는 데 있어서의 역할에 대한 더 직접적인 증거는 IGF-2 analogue를 receptor 기능의 probe로 사용하는 데서 알 수 있음.
n type 1 receptor에 대한 친화도가 감소해 있지만 type 2 receptor에 대한 친화도는 유지하고 있는 IGF-2 analogue는 DNA 합성에 있어서 IGF-2보다 훨씬 약한 효과
n type 2 receptor가 IGF-2의 mitogenic effect를 매개하지 않는다는 것을 더 지지하는 사실로, 닭이나 개구리의 간 조직에 있는 mannose-6-phosphate receptor가 IGF-2에 붙지 않는 다는 것을 알 수 있음à 이런 종에서의 IGF-2의 mitogenic action은 오직 type 1 IGF receptor에 의해서만 매개되는 것 같음
- 그럼에도, 많은 관찰에 의하면 type 2 IGF receptor를 매개한 IGF-2 활동의 가능성은 여전함
n Rogers 등에 의하면 type 2 receptor는 개의 신장의 membrane과 proximal tubule에 있는 inositol triphosphate와 diacylglycerol의 생산에 관여한다고 함
n Tally 등에 의하면 IGF-2는 K562 human erythroleukemia cell line의 subclone 성장을 자극하며, 이것은 IGF-2나 insulin 등에 의해 복제되지 않음
n Minniti 등에 의하면 IGF-2는 autocrine growth factor 및 사람의 rhabdomyosarcoma cell에서 cell motility factor로 작용할 수 있으면 이런 작용은 type 2 receptor에 의해 매개됨
n IGF-2는 type 2 IGF receptor를 통해 아마도 pertussis toxin-sensitive guanine nucleotide-binding protein(Gi proteinein)과의 coupling을 통해 calcium-permeable cation channel를 활성시킬 수 있는 것으로 보임
- Type 2 IGF receptor는 IGF-2 뿐 아니라 다른 여러 분자에 붙는 것으로 보임
n 이러한 receptor가 mannose-6-phosphate-containing enzyme(cathepsin이나 urokinase 등)에 붙는 능력은 잘 알려져 있으며
n 그러한 능력 안에서 cellular environment로부터 이러한 enzyme을 제거하므로서, 조직 remodeling을 조절하는 것이 중요함
n 게다가, 연구들에 따르면, type 2 IGF receptor는 retinoic acid에 붙어 retinoids의 성장 억제 효과를 매개함
n 이번 장의 뒤에서 논의될, type 2 IGF receptor의 knockout은 과다성장을 초래
n 이런 receptor는 다양한 anti-mitogenic system을 매개하고 그에 대한 IGF system의 성장억제요소로서 작용함
- 표면상 비정상적인 경쟁적 binding을 우연히 관찰한 결과, variant 또는 비전형적인 insulin과 IGF receptor가 존재가 제안됨 à 한가지 가능한 설명은 insulin receptor에서 1개의 alpha-beta dimer와 type 1 IGF receptor에서 1개의 alpha-beta dimer로 구성된 hybrid receptor의 존재
n Treadway 등에 의하면 hybrid IGF/insulin receptor에서 ligand-dependent formation이 발견 되었으며
n Insulin과 type 1 IGF receptor에 specific한 Monoclonal Ab에 관한 연구에서도, 그런 receptor는 세포 내의 충분한 native receptor들과 함께 자연스럽게 발달
n 그러한 hybrid receptor의 생리적 중요성은 잘 밝혀지지 않았음
